Niederle gilt als Begründer der modernen Archäologie in den Böhmischen Ländern.
Er studierte ursprünglich klassische Archäologie an der Karlsuniversität in Prag und widmete sich später auch der Anthropologie und insbesondere der Ethnologie. Nach Studienabschluss in Prag setzte er sein Studium in München und Paris fort. Er interessierte sich intensiv für slawische Funde und unternahm hierzu zahlreiche archäologische Reisen (zum Studium der Ethnogenese der Slawen).
Im Jahr 1898 wurde er zum Professor der Karlsuniversität ernannt
und wurde Vertreter der theoretischen "Universitätsschule". Diese stand in Opposition zur "Museumsschule" von Prof. Píče, und ihre gegenseitige Polemik endete gar mit Prof. Píčes vorzeitigem Tod. Niederle widmete sich sowohl der Popularisierung der Archäologie als auch ihrer Verankerung als renommiertem Universitätsfach. Er gründete das Staatliche Institut für Archäologie und war dessen erster Direktor. Er redigierte zahlreiche Fachperiodika und war ein Pionier der Zusammenarbeit zwischen Ethnologie und Archäologie.
